mRNA疫苗是一类新型的核酸疫苗，被接种到机体后能作为模板编码病原体或癌细胞产生的外原蛋白诱导和激活机体的免疫系统产生免疫反应，从而达到预防和治疗疾病的目的。

     随着核酸修饰和递送载体技术的发展，mRNA疫苗的临床转化逐渐得以实现，并被广泛用于传染性疾病、肿瘤和罕见病的研发。mRNA疫苗的非临床研究，不仅要遵循针对疫苗的相应指导原则，如WHO分别针对疫苗及其佐剂的指导原则，还应满足2021年WHO出台的评估预防性传染病的mRNA疫苗的质量、安全性和有效性的监管考虑内容。该内容明确提出mRNA疫苗的非临床研究需阐明mRNA和脂质纳米粒（LNP）递送载体或其成分在体内的分布情况以及留存时间。

        mRNA疫苗组织分布的研究方法包括定量和定性分析两大类。定量分析mRNA在组织中含量可使用逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）。定性分析方法可采用正电子发射计算机断层显像（PET-CT）、近红外成像技术结合、免疫荧光技术以及放射性同位素标记法等。

1、RT-qPCR

RT-qPCR是一种高度灵敏的技术，可定量检测到很低拷贝数的RNA。它首先以mRNA为模板，在逆转录酶的催化下合成互补DNA（cDNA），然后再以cDNA为模板通过qPCR扩增目的基因。在变性-退火-延伸的循环反应中，DNA产物的量呈指数型增长，体系中荧光分子发出的信号与DNA产物的量成正比并被实时分析，从而计算出PCR产物的量。在mRNA疫苗的非临床组织分布研究中，受试动物被解剖后其血液、骨髓、膝关节、肌肉大脑、心脏、肺、肝脏、脾脏、肾脏、淋巴结和注射部位肌肉等常需进行mRNA含量的分析。血液和骨髓可以直接用于mRNA的提取，而一些较大的组织脏器被随机选取部分位点匀浆后用于mRNA的提取，经过逆转录获取cDNA后进行qPCR扩增。RT-qPCR的体系需要经过优化并经验证，比如方法的检测限、标准曲线的定量范围、精密度和准确度、特异性、选择性以及基质干扰等。目前，对于qPCR和RT-qPCR用于基因和细胞治疗药物的分析方法尚未有具体的行业指南和法规，所以各评价机构对于方法的验证内容和接受标准也各不相同。

2、PET-CT与近红外成像技术

PET是将标记有能发射正电子的放射性同位素的化合物注射到受检者体内，让受检者在PET的有效视野范围内进行呈像，CT是根据组织对X射线吸收不等的特点而得到的受检者的解剖结构图像。两者的融合，既能提供受检者体内被标记化合物的信息，又能对被标记化合物进行精确定位。从而，在临床上为查找和确定肿瘤及病灶提供精确的位置信息，并为定性定量诊断提供依据。Santangelo课题组首次将无损伤性PET-CT和近红外成像结合对mRNA疫苗在食蟹猴中的组织分布做了追踪和检测。在该研究中，黄热病（YF）prME mRNA被选作为模型系统，放射性同位素⁶⁴Cu被标记在能与抗原mRNA的3’端互补配对的近红外荧光探针上，所以将mRNA疫苗注射至食蟹猴体内后，由PET-CT和近红外成像技术检测到的放射性⁶⁴Cu和近红外荧光信号就暗示了mRNA在体内的存在和位置。

3、免疫荧光技术与放射性同位素标记法

在mRNA疫苗组织分布研究中，除了直接检测mRNA分子外，也可以通过免疫荧光技术检测mRNA翻译的病原蛋白间接追踪和分析mRNA。免疫荧光技术是利用抗原抗体反应的特异性结合的原理，首先将已知的抗体标记上荧光分子并将其作为探针，通过荧光显微镜的观察从而定位细胞或组织中的抗原物质。由于荧光免疫技术特异性强，灵敏度高，所以在临床和非临床的病理诊断和检验中应用广泛。荧光素酶具有生物发光特性常被用于生物发光成像分析，荧光素酶mRNA作为报告基因可以在体内翻译出荧光蛋白，在荧光显微镜下可以观察其在细胞和组织中的定位。在已批准上市的COVID-19mRNA疫苗Comirnaty的非临床试验中，研究人员使用荧光素酶mRNA替代病原体mRNA在小鼠体内做了mRNA的组织分布研究，同时还将荧光素酶mRNA经同位素³H标记的脂质纳米粒包裹后注射到大鼠体内，对mRNA和其LNP递送载体两者均做了组织分布研究，更加全面分析mRNA疫苗的潜在靶器官。根据实验的观察结果，使用³H标记脂质纳米粒的方法表现了出比荧光素酶更高的灵敏度。

      基于人们对疾病基因相关机制认识的不断深入和mRNA疫苗自身的优势，我们相信mRNA疫苗在未来必将得到突飞猛进的发展，而对mRNA疫苗组织分布的研究方法也必将更多样、更高效和更灵敏，更好的为mRNA疫苗的开发、非临床和临床研究服务。成都华西海圻作为一家专业从事药物非临床试验与国际接轨的GLP中心之一，紧跟新药研发的前沿方向，在mRNA疫苗的非临床安全性、有效性、组织分布等研究方面已积累了丰富经验，可以为客户提供国内、美国、欧盟、日本、韩国等多边申报服务，我们期待与更多的新药研发单位合作。